材料和方法1021显微风格实验10211实验设置
微观尺度的实验是在雷焦卡拉布里亚地中海大学的温室设施中进行的。微观世界由9.5升PVC管(30厘米高x 20厘米直径)填充约13公斤的土壤/珍珠岩(80/20,v/v)混合物。土壤类型为粘土壤土[砂36.0%，粉砂32.0%，粘土32.0%;堆积密度1.23±0.04 kg dm-3;pH-H2O 7.2±0.2;pHKa 6.4±0.1;总有机碳(TOC) 19.3±0.4 g (kg dw[干重基础]土壤)-1;总N (TN) 1.8±0.2 g kg-1;C/N比10.7;NH4+-N 17.1±1.0 mg kg-1; NO3--N 13.0 ± 1.0 mg kg-1; Olsen P 18.3 ± 2.3 mg kg-1; total CaCO3 8.4 ± 1.0 g kg-1; active CaCO3 3.9 ± 0.2 g kg-1; cation exchange capacity (CEC) 17.1 ± 1.7 cmol(+) kg-1; electrical conductivity (EC at 25°C) 0.165 ± 0.004 dS m-1 (1 dS m-1 = 1,000 mS cm-1)] sampled from the surface (0-15 cm) Ap horizon of an agricultural field located in the Agricultural Experimental Station of the Mediterranean University of Reggio Calabria. After coarse sieving (4 mm mesh), the freshly collected soil was thoroughly mixed with commercial perlite (Agrilit®3, purchased from Perlite Italiana s.r.l., Milano, I) at 70/30 (v/v) soil/perlite ratio. Perlite properties were: particle size 2-5 mm, bulk density 100 ± 20 kg m-3, pH 6.5-7.5, CEC 0.79 cmol(+) kg-1, EC 0.020 dS m-1, water content at -1 kPa 26.30%, water availability 12.97%. Microcosms were closed at the bottom by a thin layer of nylon stocking material, separated from the soil/perlite mixture by a 1-cm drainage layer of water-washed quartz sand.堆肥(pH-H2O 8.7, EC1:10 3.357 dS m-1, TOC 28.75%， TN 2.24%， C:N比12.8)由GESENU(佩鲁贾，意大利)提供。根据Traylor et al.(1984)的方法，经Piccolo et al.(2005)的修饰，合成了水溶性铁卟啉[中链四(2,6-二氯-3-磺基苯基)氯化铁卟啉酸酯]，这里称为仿生催化剂(CAT)。
微观世界随机设置在2 × 4的实验区(6次重复)，有两种植物处理(有和没有玉米植物)和4种土壤的治疗方法,即:
-土壤/珍珠岩混合物，不含堆肥或合成铁卟啉，作为对照处理(CONT)。
-土壤/珍珠岩混合料以2公斤m-2率(COM)进行堆肥修正。
-土壤/珍珠岩混合物添加1克m-2合成铁卟啉(CAT);假设孔隙率是50%和15%体积含水量在现场容量下，上述CAT速率将在土壤溶液中产生大约10毫米的CAT浓度。
-土壤/珍珠岩混合物在微观填充后用堆肥(2千克m-2)修正，然后在微观填充后10天表面喷洒铁卟啉(1克m-2) (COM + CAT)(见下文)。
合成铁卟啉在微观填充后很快被表面喷洒在CAT和COM + CAT处理上作为缓冲溶液(100 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0)。德-离子水定期添加到土壤微观系统中，以保持土壤总体积的13 - 15%之间的水分。
试验开始55天后，将已发芽的玉米种子(Zea mays L.， var. Cecilia，由Pioneer HI-Bred Italia s.r.l.， Parma, Italy提供)移植到土壤微观世界中(每个微观世界一株苗)，再让其生长21天。
在76 d的试验期内，温室空气温度根据昼夜周期和外部天气条件在12 ~ 25℃之间波动，土壤温度在16 ~ 21℃范围内略有变化。
10.2.1.2植物取样及根系形态拓扑分析
试验期结束时，破坏土壤微观取样，将21日龄玉米植株轻轻分离成茎部和根部，用去离子水冲洗，称重测定鲜重。在70℃烘箱中干燥48小时后测量枝条干重(WS, g)。用0.1% (w/v)甲苯胺蓝O染色5分钟，然后以600 dpi分辨率扫描(WinRhizo STD 1600, Instruments Regent Inc.，加拿大)。
为了进行拓扑分析(Fitter 1986)，采用WinRhizo Pro v. 4.0软件包(Instruments Regent Inc.， Canada)测量根系中外部链接数的大小(m)和最长单路径链接数的高度(a)。这些参数允许计算拓扑指数(TI = [(log a)/(log la)] (Glimskar 2000)。TI值接近1表示“人字形”根结构，其中分支主要局限于一个主轴，而值接近0.5则表示具有更多随机分支的二分根结构。
在形态学分析中，整个根系的长度(LR, cm)和体积(VR, cm3)以及直径等级内的总根长(“细根”:0-0.4、0.4-0.8和0.8-1.2 mm;“粗根”:1.2-1.6,1.6-2.0,2.0-2.4,2.4-2.8，>2.8 mm)测量(WinRhizo软件)。随后，在烤箱干燥(70°C)直到达到恒定重量后，测定根系干重(WR, g)。总植株干重(WP, g)由WR和WS之和得到。基于上述测量结果，计算根系结构参数的根细度[(F = LR/VR)、cm根长(cm3根体积)-1]和组织质量密度[(TD = WR/VR)、g根(cm3根体积)-1]。这些参数之间的关系如下:LR = WR*(F/TD) (Ryser and Lambers 1995)。通过根质量比[(RMR = WR/WP)， g根(g株)-1]评价根系分配的相对生物量。
10.2.1.3土壤分析
使用封闭动态土壤CO2通量系统(LI-8100自动土壤CO2通量系统，LI-COR公司，林肯，内拉斯加州，美国)定期监测土壤呼吸，该系统配备了一个10厘米的测量室，用于测量土壤CO2流出(mmol CO2 m-2 s1)。随着时间的推移，还监测了体积土壤湿度(ECH2O EC-5探头，Decagon Devices, Pullman, WA, USA)和土壤温度(Omega探头，E型，LI-COR公司)(5厘米深度)。在试验开始(第0天)和结束(第76天)采集土壤样品。使用标准方法测定pH、EC、TOC和TN (Sparks 1996)。
10.2.1.4统计
首先检验土壤变量、植物生长、根系形态和拓扑参数是否偏离正态(Kolmogorov-Smirnov检验)和方差齐性(Levene中位数检验)。由于阻滞效应不显著(p > 0.05)，采用Systat 12.0软件(Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA)对数据进行统计分析。均数两两比较采用Tukey事后检验比较(p < 0.05)。对图10.10和10.11的数据分别采用重复测量的双向方差分析(ANOVA, CAT x COM)和重复测量的三向方差分析(ANOVA, CAT x COM x植株)进行统计处理，以突出处理(CAT、COM和玉米植株)的主要影响以及随时间的变化。
10.2.2实验室研究种子发芽萌发后过程
以两种适于实验室研究的速生易栽培植物为研究对象，评价了CAT对植物种子萌发和幼苗建立的影响，如园芥(Lepidium sativum L.)和胡萝卜(Daucus carota L.)。使用的CAT浓度应与微观实验中使用的CAT浓度在同一范围内(见上文);0(对照)、3、9、27、81或243 mM。这些都是在pH为6.0的无菌10mm磷酸盐缓冲液中，从相同缓冲液中10mm CAT溶液的无菌原液中稀释适当体积得到的。在20°C的黑暗条件下，在含有滤纸盘的培养皿中，以上述浓度的CAT溶液进行发芽处理。假设胚根突出表示种子萌发完成，开始成苗，即测量根、芽生长的“零时间”。
根据Lichtenthaler et al.(1982)的方法，用丙酮/水(80/20,v/v)提取叶片，用分光光度法测定叶绿素a和叶绿素b以及总类胡萝卜素。
每个报告的结果都是在重复的3-5个独立实验中进行的至少10次测量的平均值±标准差。
10.2.3根系生长和形态的实验室研究
将拟南芥哥伦比亚生态型(Col-0)的种子在4℃的黑暗条件下无菌培养24 h蒸馏水．然后将种子播种到方形培养皿(10cm x 10cm)上，培养皿中含有40ml无菌的半强度MS培养基(Murashige和Skoog 1962)， 3% (w/v)蔗糖，0.7% (w/v)植物琼脂，最终CAT浓度为0(对照)，3,9或27pm，这些CAT浓度通过稀释于灭菌的10mm磷酸盐缓冲液(pH为6.0，从相同缓冲液中灭菌的1mm CAT溶液中取适当体积)获得。含有发芽种子的培养皿在25°C下孵育，光照时间为16 h，黑暗时间为8 h，垂直放置，以避免根在培养基中渗透。这样可以更容易地测量主根的生长，并可视化根毛和侧根。分别在种子发芽后5、8、11和14天进行测量。如前所述，对拟南芥根器官进行了图像分析。用98倍放大的立体显微镜(Olympus MIC-D)分析根毛参数，即延伸区、数量和长度。通过测量叶片直径和计数叶片莲座数进行枝条分析。
每个结果是3-5个重复的独立实验中每次至少进行10次测量的平均值±标准差。
10.3结果与讨论
10.3.1微观尺度实验中的根形态拓扑
根通过将死根和光同化的C沉积在根际，可以充当土壤中的二氧化碳汇(Tresder et al. 2005)。相反，根系可以被认为是土壤CO2的生物来源，通过根系组织呼吸，间接刺激微生物活动。除了CO2的源/汇效应，根还通过释放易分解的碳源，对SOM矿化的速度和程度发挥间接作用，通常被称为根刺激SOM衍生的CO2启动效应(Cheng和Kuzyakov 2005;Dijkstra和Cheng 2007;程2008)。
根系形态和拓扑结构是评价根系在土壤碳动力学中功能作用的主要因素。事实上，根长、表面积、直径等级和拓扑结构等因素可能对CO2源电位有影响，而根质量比、细度和组织密度等因素则与CO2有关水槽容量．在这方面，我们分析了这些根参数对CAT或COM修改的响应，无论是单独添加还是组合添加。
CAT处理增加了玉米植株的总生物量，相反，仅添加COM则保持不变。然而，两种处理组合对植物总生物量产生了协同效应(图10.1)。结果反映了根和茎干重观察到的独立模式(图10.2)。
Cont com cat com + cat
图10.1玉米植株总生物量(茎部+根系)(cv。Cecilia)生长在充满对照土壤CONT的实验显微镜中;堆肥修正土，COM;铁卟啉、CAT改性土壤;堆肥和铁卟啉处理的土壤，COM + CAT。数值为平均值(n = 6)±平均值的标准差。不同字母表示对照的统计学显著差异(CONT;Tukey检验，p < 0.05)
Cont com cat com + cat
图10.1玉米植株总生物量(茎部+根系)(cv。Cecilia)生长在充满对照土壤CONT的实验显微镜中;堆肥修正土，COM;铁卟啉、CAT改性土壤;堆肥和铁卟啉处理的土壤，COM + CAT。数值为平均值(n = 6)±平均值的标准差。不同字母表示对照的统计学显著差异(CONT;Tukey检验，p < 0.05)
COM处理增加了植株根长，但不显著，CAT处理对根长无显著影响。正如已经观察到的生物量参数(图10.1和10.2)，当CAT和COM一起添加到微观世界时，可以注意到协同效应(图10.3)。此外，COM处理显著增加了细根类根系的累积长度(直径范围0-0.4 mm)， COM + CAT处理的增加幅度更大(图10.4a)。相反，CAT单独或与COM联合使用均显著增加粗类(直径类，>1.2 mm)的根系累积长度，而较大直径类单独添加COM则没有反应(图10.4b)。
单独两种处理，甚至结合两种处理，都倾向于增加根表面积(图10.5)。通过解剖处理对直径等级的表面积的影响，得到了与根长观察到的相似的模式(见上文;将图10.6与图10.4进行比较)。然而，任何处理都没有改变玉米根系的拓扑指数，其结构仍为“人字”型(TI~1;数据未显示)。
除了根系形态特征可能会增加土壤中二氧化碳的释放(土壤作为二氧化碳源)外，我们还评估了根系形态的那些成分，这些成分直接或间接地有可能增强土壤中的碳储量，从而促进其作为二氧化碳汇的作用。为此，我们计算了(1)根质量
12日0
10日0
鲜重干重
续
COM +的猫
图10.2图10.1中玉米植株的茎部(a)和根部(b)生物量。首字母缩略词和统计数据如图10.1所示
续
COM +的猫
图10.2图10.1中玉米植株的茎部(a)和根部(b)生物量。首字母缩略词和统计数据如图10.1所示
(2)根系细度(F)和根系组织密度(TD)，这是根系的结构成分。特别是，RMR显示了植物向土壤分配光合固定碳的潜力，而F和TD参数提供了“根系生物量质量”的间接信息，这可能对土壤中根系退化后土壤C的稳定产生影响。研究发现，TD与根周转率呈负相关(Ryser 1998)，与根细胞壁厚度、根截面积呈正相关(Wahl and Ryser 2000)，最后与外皮木质化程度呈正相关(Eissenstat and Achor,1999)。
图10.3图10.1中玉米植株的根总长度。首字母缩略词和统计数据如图10.1所示
因此，大的TD和/或低的F都表明根系木质化程度高，其所谓的顽固性减缓了根系在土壤中的退化。
这里报道的结果表明，与CAT相比，COM处理诱导了更大的生物量分配到根系(图10.7中更大的RMR)。就结构成分而言，CAT处理显著降低了根系的细度，这意味着大直径根轴的普遍存在，而COM处理或单独或联合CAT处理均显著提高了这一参数(图10.8)。值得注意的是，无论是单一处理还是联合处理，根系组织密度都降低了(图10.9)。根据前面的考虑，这意味着在施用COM和/或施用CAT处理的土壤中，根系抵抗降解的能力下降，导致根系周转速率加快。
综上所述，上述结果存在争议，表明CAT和COM在土壤碳平衡中扮演着双重来源/汇的角色。一方面，CAT增加了粗根的根表面积和长度，可能导致根系与土壤的表面接触增强，从而促进土壤CO2的排放。另一方面，仿生催化剂减少了细根长度，从而减少了根系分泌物的释放，这意味着根际生物群对可呼吸基质的供应减少，从而减缓了土壤CO2排放速率。
同样地，堆肥改性在增加细根的根表面积和根长方面与CAT表现相似，两者都可能促进植物源性CO2释放。然而，COM同时促进了细根长度的增加，从而促进了根沉积，并增加了根系的生物量分配，从而表明堆肥可能促进了根系作为土壤CO2汇的作用。因此，CAT + COM复合处理加剧了根系作为土壤碳平衡源或汇的对比作用。
Cont com cat com + cat
一个 |
21 |
18 |
|
15 |
|
米 |
|
12 |
|
CT |
|
C |
|
e |
9 |
6 |
|
3. |
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rnf H >我 0-400 400-800 800-1200 直径等级 |
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