固氮酶y的表征蛋白质变异Sitedirected诱变产生的
美国生物化学、威斯康辛大学麦迪逊分校,WI
Dinitrogenase heterotetrameric(包含iron-molybdenum (X2P2)酶辅助因子(FeMo-co)在其活性部位。固氮菌vinelandii突变株不能合成FeMo-co积累一个apo dinitrogenase, 0 ^ 272亚基组成,可以通过添加FeMo-co体外激活。y亚基可以与FeMo-co和apodinitrogenase交互,导致的建议促进FeMo-co插入到酶蛋白。
y non-nif基因编码蛋白最近克隆、测序,发现编码一种NifY-like蛋白,属于NifY / NifX VnfX家族的铁和钼(或钒)cluster-binding蛋白质(卢比奥et al .,手稿准备)。比较他们的氨基酸序列指着唯一守恒的半胱氨酸(Cys166 y序列)作为集群绑定和一个好的候选人,因此,我们产生的变体y蛋白质与阿拉巴马州或Ser Cys166。纯化制剂的野生型和突变体变体y用于比较他们的绑定属性FeMo-co apodinitrogenase。结果提出了工作与一个角色相一致Cys166 y-FeMo-co稳定的复杂。
乙炔还原与固氮菌VINELANDII Mo -固氮酶:谷氨酰胺的作用- 191 MoFe蛋白质的亚基
k . Vichitphan星河的牛顿
生物化学部门,弗吉尼亚理工学院和州立大学的布莱克斯堡,弗吉尼亚州24061,美国
1。介绍
FeMo-cofactor (FeMo-co)是两种类型的假体组中发现两个固氮酶组件的更大的蛋白质,称为MoFe的蛋白质,和强烈与衬底绑定和减少站点。谷氨酰胺- 191 MoFe的亚基蛋白残留是针对P之间的替换,因为它位于集群(第二种类型的假体组MoFe的蛋白质)和FeMo-co。此外,其侧链是参与形成氢键网络从一个终端homocitrate组件的羧酸盐的FeMo-co通过年龄的骨干NH - 61,这是毗邻P cluster-ligating残渣,acys - 62。替换的影响在位置a - 191 FeMo-co的属性可以通过氢键和homocitrate-Mo连接介导的。替换与赖氨酸在这个位置,给阿里- 191改变MoFe蛋白质,产生一个不寻常的表型,
1. e。没有固氮作用,CO-sensitive H2进化,乙炔亲和力低、C2H6形成从乙炔还原(Scott et al . 1992;费舍尔et al . 2000年)。
2。结果与讨论
各种改变MoFe的蛋白质,即激光器- 191、ahi - 191, aglu - 191和aarg - 191改变MoFe的蛋白质,被净化的同质性和有以下结果与野生型相比MoFe的蛋白质。所有四个改变MoFe蛋白质催化活性的下降了,但是带电氨基酸侧链减少催化活性更多(37%和18%的野生型Ar aglu - 191和aarg - 191年单独改变MoFe蛋白质,分别)。pH值基于剖面研究中,催化活性的下降可能是由于转变的pKa deprotonated和/或使质子化组(s),导致改变pH值为最大的活动。C2H2/90% Ar的10%,四个改变MoFe蛋白质电子通量的减少使用乙炔还原(21 - > 46%)比野生型(89%)。乙炔还原电子分布的下降率与乙炔亲和力下降(公里)高。此外,激光器- 191改变MoFe蛋白质展品为乙炔还原反应两相的pH值8.0有两公里(0.007和0.800 atm C2H4乙炔的生产),这表明至少两个乙炔结合位点。aglu ahi - 191——191年,aarg - 191改变MoFe蛋白质产生乙炔由于乙烷(C2H6)较高公里的乙炔还原和pKa转变。这些结果表明谷氨酰胺在位置a - 191有影响在乙炔结合位点(s)和负责任的pKa质子化了的/ deprotonated组(s)在固氮酶的催化。
3所示。引用
斯科特DJ et al。(1992)生物。Fisher化学。267年,20002 - 10 K et al。(2000)生物化学。39岁,29070 - 79
4所示。确认
我们感谢k . Fisher博士和美国国立卫生研究院(给予W.E.N dk - 37255)。
AZOTOBACTOR VINELANDIINITROGENASE包含改变MoFe蛋白质与替换- 278 ser:底物和抑制剂之间的交互
部门的生物化学、弗吉尼亚理工大学,布莱克斯堡,弗吉尼亚州24061,美国
1。介绍
FeMo-cofactor两种假体组绑定在MoFe固氮酶的蛋白质。FeMo-cofactor的多肽环境似乎密切参与MoFe的微妙控制蛋白质的相互作用的底物和抑制剂(费舍尔等啊2000)。在这部作品中,亚基278 - MoFe蛋白质的丝氨酸残基的目标。改变MoFe的蛋白质Azotobactor vinelandii Mo-nitrogenase, - 278用力推,a - 278 -半胱氨酸,阿拉巴马州- 278和- 278低浓缩铀MoFe蛋白质,用于研究H +之间的交互,乙炔,CO和N2。
2。结果与讨论
所有菌株除Nif - 278低浓缩铀突变。我们决定改变MoFe的乙炔还原公里的蛋白质。阿拉巴马州- 278和- 278半胱氨酸MoFe蛋白质显然绑定乙炔与野生型相似,而- 278刺和a - 278 -亮氨酸MoFe的蛋白质都有一个公里10倍高于野生型乙炔还原,与野生型,产生C2H6影响这些结果表明C2H2-binding站点- 278 ser位置替换。像野生型,N2也是一个竞争性抑制剂减少- 278用力推,乙炔的a - 278 -半胱氨酸和a - 278 -阿拉巴马州MoFe蛋白质,但对N2的Kj抑制高于野生型MoFe的蛋白质。
降低乙炔时,阿拉巴马州- 278和- 278半胱氨酸MoFe蛋白质应对公司与野生型相似,而a - 278 -刺MoFe蛋白质更敏感nonsaturating浓度下有限公司有限公司的a - 278 -亮氨酸MoFe蛋白质催化乙炔在s形动力学的减少,这是符合inhibitor-induced两个C2H4-evolving网站之间的协同。这种现象以前观察到hls MoFe蛋白质,与a - 277 - a - 277 - arg的替换由组氨酸(沈et啊1997)。这些数据表明,MoFe蛋白有两个C2H2-binding网站,其中一个似乎是位于278 - 277附近残留,因此,最有可能在Fe4S3 FeMo-cofactor的子集。
3所示。引用
学生物化学沈等啊(1997)。36岁的费舍尔4884 - 4894 K等学生物化学啊(2000)。39岁,2970 - 2979
4所示。确认
由美国国立卫生研究院(dk - 37255)。
继续阅读:结果与讨论Xav
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