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第八部分:压力和限制固氮作用的因素
抗氧化保护豆类根结节
Iturbe-Ormaetxe,硕士马塔莫罗斯,参考莫兰,j·拉莫斯,贝拉卢比奥,核磁共振克莱门特,Heras, m . Becana
Estacion实验de教室一些,CSIC Apdo。202年,50080年西班牙萨拉戈萨
1。介绍
豆类结节包含一系列令人印象深刻的抗氧化剂应对活性氧(ROS),如超氧化物自由基和过氧化氢,生成在不同亚细胞的隔间。ROS参与豆科根瘤发展的所有阶段,从起始到衰老(Becana et al . 2000;桑托斯et al . 2001年)。结节细胞溶质,ROS主要形成于氧化反应涉及豆血红蛋白和回收通过一致行动CuZn-superoxide歧化酶(SOD)和四种酶的Halliwell-Asada通路(1995道尔顿)。在这个通路,抗坏血酸盐过氧化物酶(APX型)催化抗坏血酸盐的过氧化氢还原成水,和结果monodehydroascorbate dehydroascorbate减少抗坏血酸盐,分别由monodehydroascorbate还原酶(MR)为代价的NADH和dehydroascorbate还原酶(DR) +谷胱甘肽还原酶(GR)的NADPH。一个关键代谢物活性氧的解毒途径的结节是谷胱甘肽(谷胱甘肽;yGlu-Cys-Gly)合成两类细菌和植物分数由两个ATP-dependent酶,y-glutamylcysteine合成酶和谷胱甘肽合成酶(谷胱甘肽),表演顺序(莫兰et al . 2000年)。然而,一些豆科物种和组织可以合成另一个硫醇三肽,homoglutathione (hGSH;yGlu-Cys-pAla),除了或代替谷胱甘肽。一般认为hGSH合成了特定hGSH合成酶(hGSHS),它执行类似的角色,谷胱甘肽(Klapheck 1988; Matamoros et al. 1999).
线粒体也是一个主要站点生成活性氧的结节,因为这些丰富的细胞器在皮层和受感染的地区(米勒et al . 1995),呼吸所需的高活跃N2固定(道尔顿1995;米勒et al . 1995年),他们的高血红素含量和nonheme菲,这可以从过氧化氢催化羟基自由基的形成(Becana et al . 1998年)。然而,很少有人了解结节线粒体的抗氧化成分。
在这个工作我们现在数据三个方面对结节的抗氧化保护。首先,我们报告记录的变化丰富抗氧化酶在根瘤衰老。第二,我们已经在一个不同的系统,具有功能hGSHS首次从结节。第三,我们分析结节线粒体的抗氧化成分和过氧化提出一个模型在这些细胞器解毒。
2。材料和方法
2.1。北部的分析。总RNA提取豌豆phenol-LiCl结节的过程(维尔沃尔德et al . 1989年),在琼脂糖变性(甲醛)凝胶分离,毛细管转移到Hybond-N +尼龙过滤器(Amersham)。准备的污点和DNA探针杂交random-primed 32 p-labeling和放射自显影法进行以下标准协议(Sambrook et al . 1989年)。
2.2。重组GSHS2超表达、纯化和表征。GSHS2开放阅读框的扩增使用gene-specific菌进行基因引物(莫兰et al . 2000年)。结果1.7 kb片段凝胶纯化,subcloned成pCRII威尼斯平底渔船(表达载体),和变成DH5a主管细胞。插入的开放阅读框的GSHS2 Ncol和消化
Notl、凝胶纯化和结扎成pFastBac HTb。积极的殖民地转变DH5a细胞被确定使用pFastBac特定的引物PCR。重组bacmid DNA在大肠杆菌生长,孤立和用于使转染Sf21细胞。摘要杆状收获72 h post-transfection和放大通过感染昆虫细胞单层培养。优化后感染条件下,蛋白质产量扩大了昆虫细胞培养在50毫升27°C的tc - 100中(σ)补充10%胎牛血清(σ)和抗生素。收集细胞病毒感染后48 h和细胞溶解渗透冲击。免费细胞提取物被加载到一个钴亲和柱(Clontech)。分数与咪唑和受到西方分析和筛选了蛋白质染色证实GSHS2的存在和纯度。
2.3。测定抗氧化酶和代谢物。GPX活性化验焦棓酸为底物,包括0.5毫米p-chloromercuriphenylsulfonic酸(潜热)反应混合物(Amako et al . 1994年)。所有其他的酶活性测定如前所述(Gogorcena et al . 1997年)。硫醇三肽是量化通过高效液相色谱荧光检测(马塔莫罗斯et al . 1999年)。
2.4。本地化结节线粒体的酶。线粒体净化是使用修改出版协议和执行监控使用细胞器蛋白质标记(Sandalio et al . 1987;Struglics et al . 1996年)。增溶和延迟的研究进行了本质上所描述的吉梅内斯et al . (1997)。
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