大豆结瘤早期的信号交换

陆俊杰，张斌，张永华。李，C.比克利，D.洛哈尔，G.廖，G.科普利，

M.G.史黛丝

美国田纳西大学微生物系豆科植物研究中心，诺克斯维尔，37996-0845

1.日本慢生根瘤菌结瘤基因的调控

几种(Sino)根瘤菌nod基因表达的调控!Bradyrhizobium !偶氮菌已被广泛研究。目前的证据表明，大多数nod基因参与了取代脂质-几丁质nod信号的产生，这些信号诱导根毛卷曲和皮层细胞分裂。这些基因调控的通用模型预测，nodD基因产物是组成型表达的，并与植物产生的类黄酮化学物质(例如异黄酮)相互作用，导致其他结瘤基因的诱导。这种nod基因转录控制系统对于感染过程的启动和宿主特异性的确定至关重要。

本实验室持续的研究表明，在(Sino)根瘤菌种中定义的nod基因调控的通用模型不能充分解释B. japonicum中nod基因转录的控制。事实上，日本白桦的nod基因调控显示出惊人的复杂性(图1)。我们的数据显示，日本白桦使用三个不同的全局调控蛋白家族的成员来控制nod基因的表达。具体来说，一个lysr型调节器，

图1。日本慢根瘤菌nod基因表达的调控是复杂的，涉及多个阳性(+)和阴性(-)调控因子。在这种复杂性的基础上，我们现在可以通过四聚体节点信号(NF)和一种新的仲裁信号添加负反馈调节。它们通过NolAl和NodD2起作用。

NodDl和双组分调控系统NodVW在响应植物产生的异黄酮信号时正向调控nodYABC基因表达(Loh et al. 1997,1999,2001;Loh, Stacey 2001)。此外，作为mer型调控家族的一员(见下文)，NolA可以间接抑制nod基因的表达(Dockendorff et al. 1994;Garcia et al. 1996)。no I A基因在细菌中是一种罕见的情况，一个基因编码三个不同的多肽(Loh et al. 1999)。最大的蛋白NolAl是一种转录调节蛋白，是诱导nolA2,3和nod2所必需的。最小的NolA蛋白，NolA3，似乎在结瘤中有一个重要的，尽管尚未定义的功能。NodD2是nod基因表达的抑制因子。因此，NolA 1的表达最终导致nod基因表达下调。

我们实验室的最新数据(如下所述)表明，NolA是一种中枢调控成分，允许细胞对各种信号分子做出反应，并精细地调节nod基因的表达。图1展示了我们目前对日本白僵菌nod基因调控的工作模型。这种复杂的调节回路的净效应是为机体提供nod基因表达精细调控的响应机制，并将这种调控整合到细胞的整体代谢中。

日本白蛉有两个nodD基因，串联排列为nodDxnodDj。NodD2是B. japonicum (Garcia et al. 1996)、Bradyrhizobium sp. (Arachis) NC92 (Gillette and Elkan 1996)和Sinorhizobium sp. strain NGR234 (Fellay et al. 1998)中nod基因表达的抑制因子。NolAl正激活NodD2的表达，调控NolA的表达可以有效控制nod基因的抑制。因此，NolA是结节形成的中心负调控因子。

在旨在测量nod-lacZ表达的实验过程中，我们观察到，当在NodC突变体中检测时，nod-lacZ融合始终表现出更高的活性。NodC是一种几丁质合成酶，参与合成脂质-几丁质Nod信号的几丁质骨架。这些数据以及其他观察结果使我们假设Nod信号可以通过nola - nod2抑制途径反馈调节Nod信号合成。作为这一假设的第一个测试，我们测试了各种甲壳素寡聚物(d.p -l-8)诱导nolA-lacZ和nodD2-lacZ表达的能力。获得的数据表明，几丁质寡聚物确实诱导nolA的表达，其中几丁质四聚物最活跃(Loh和Stacey 2001)。甲壳素四聚物在低至1 nM时作为nolA诱导物具有活性，在10 nM时具有最佳活性。进一步的实验表明，甲壳素对NolAl表达的影响是特异性的(数据未显示)。

不同的根瘤菌产生的NodC蛋白决定了Nod信号的链长。例如，S. meliloti的NodC主要合成甲壳素四聚物。相比之下，S. sp.菌株NGR234的NodC主要产生一种甲壳素五聚体，而B. japicum的NodC同时产生一种甲壳素四聚体和五聚体。在trp启动子的调控下，在日本血吸虫中表达了S. meliloti、S. sp. NGR234和B. japonicum nodC基因，以提高胞内产生甲壳素的水平。经转偶联表达的草霉NodC和日本白僵菌NodC的noc - lacz表达量比单载体转化的菌株低4-5倍。相反，S. sp. NGR234 NodC蛋白的表达不影响染料木素对NodC - lacz的诱导(数据未显示)。这些数据与先前的结果一致，表明甲壳素四聚物是最活跃的NolA诱导物。事实上，在NolA突变背景下，S. meliloti NodC的本构表达对NodC的表达没有影响(数据未显示)。在野生型培养物中加入浓度高达1 |im的Nod信号(一种酰基化、聚焦的五聚体)不会诱导nolA表达。然而，合成的四聚体LCOs(由日本理研所T. Ogawa提供)激活了NolA的表达，抑制了nodC-lacZ的表达。 This result was found regardless of chemical substitutions of the chitin backbone.

上述实验表明，NolA介导了细胞内几丁质四聚体水平对nod基因表达的反馈抑制。虽然日本芽孢杆菌产生的主要Nod信号是一种取代的几丁质五聚体，但我们之前的工作记录了这种细菌产生四聚体Nod信号(Cohn et al. 1999)。

在我们对nod基因调控的研究中，一个令人困惑的方面是，为了看到最大的nod- lacz表达，要求在低细胞密度下诱导细胞(用染料木素或S SE)。这一现象表明，nod基因的表达具有种群密度依赖性，在细胞密度较高时受到抑制。NolA和NodD2负调控系统的发现促使我们更仔细地研究这个问题。如图1所示，结瘤- lacz融合的诱导性(折叠诱导)随着B. japonicum细胞释放quorum信号的产生而下降(Loh et al. 2001)。种群密度不影响NolA突变背景下nodY-lacZ的表达。因此，NolA似乎直接参与了高种群密度下nod基因表达的抑制。事实上，其他使用nolA-lacZ或nodD2-lacZ融合菌株的实验表明，这些蛋白水平随着细胞密度的增加而增加(数据未显示)。

过滤后的培养上清含有一种nala - lacz诱导物，我们称之为CDF，即细胞密度因子(Loh et al. 2001)。在大多数革兰氏阴性菌中，这种群体感应化合物是修饰的高丝氨酸内酯。然而，多次尝试使用各种方法都未能从日本白僵菌培养物中分离出高丝氨酸内酯。我们现在已经成功地纯化了少量的CDF，它表现出诱导nolA-lacZ融合的能力。正如预期的那样，纯化的CDF也具有抑制nod基因表达的能力。这种化合物的化学性质目前正在调查中。

农业用日本芽孢杆菌接种剂的生产是一个重要的商业产业。生产这些接种剂的公司通常在最终将细胞与载体(如泥炭)一起包装之前，将培养物培养到高细胞密度。这种商业接种剂的一个常见问题是，它们与本土的土壤日本芽孢杆菌菌株的结核占位竞争非常差。这就是所谓的“竞争问题”。事实上，在某些情况下，商业接种剂中的日本芽孢杆菌菌株可能只占形成结节的0 ~ 1-2%。

随着CDF的发现，其诱导NolA合成的能力，同时，抑制nod基因的表达，我们获得了几批商业接种剂。提取接种剂和未接种的泥炭(对照)，并测试提取物诱导nolA-lacZ表达的能力。在所有测试的接种剂中都发现了显著的诱导剂活性(Loh et al. 2001)。对照组未接种泥炭显示很少或没有诱导剂活性。本研究的结论是，商业大豆接种剂含有大量抑制nod基因表达的化合物，因此可能会降低接种菌株的功效。为了使接种菌使植物结瘤，它必须启动生长并克服CDF的作用。这种延迟可能是接种菌株无法与通常以低种群密度(例如102“5 cfug”1)存在的本地土壤根瘤菌竞争的一个重要因素。

一段时间以来，人们已经知道，尽管结瘤的早期阶段需要结瘤基因的表达，但这些基因的表达在结瘤中受到抑制。各种各样的作者都在猜测是什么阻断了植物中的nod基因表达。最近，我们获得了令人信服的证据，表明NolAl可能通过其在群体感应中的作用，在植物中抑制nodY的表达。我们在野生型日本结核杆菌和NolA突变体BjB3中表达了结节- gus融合。用这两种菌株接种大豆植株，21天后收获结节，并对GUS活性进行染色。GUS活性仅在NolA突变株形成的结节中检测到。野生型形成的结节中未见nodY表达。与肉汤培养相比，日本芽孢杆菌在结节内没有达到可比的细胞密度。然而，在植物中，每个细菌都被封闭在一个共生体中，细菌和共生体膜之间的空间很小。因此，即使在植物中群体信号的合成很低，也可以在共生体中转化为非常高的局部浓度。

2.植物对细菌结瘤信号的反应

根瘤菌产生的已知脂质-几丁质Nod信号是取代的几丁质低聚物，通常是4 - 5个iv -乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基，在非还原性端单tv酰化，在还原性和非还原性端GlcNAc残基上携带多种取代基。每一种根瘤菌通过特定的取代产生各种各样的Nod信号。

我们实验室广泛研究了大豆Nod信号作用所需的化学特异性。总之，这些数据表明，在末端存在2- o-甲基聚焦残基，只有当LCO七氧-壳寡糖是五聚体时，还原GlcNAc对大豆的生物活性才至关重要(Cohn et al. 1997年综述)。如果LCO是四聚体，那么聚焦修饰使该分子在诱导大豆根毛卷曲或皮层细胞分裂时失去活性。因此，化学取代和LCO链长都是关键。此外，我们的结果支持了大豆Nod信号感知至少涉及两个具有不同化学特异性的离散识别事件的假设。例如，我们发现混合非集中的Nod信号可以满足水稻豆(Vigna umbellata)结瘤对集中的Nod信号的要求(Cohn et al. 1999)。其他工作检测了结瘤蛋白基因表达对Nod信号添加的响应。这些研究表明，在Nod信号作用中涉及两种化学上不同的识别事件。其中一个信号传导步骤在某种程度上是非特异性的，因为即使是几丁质低聚物(例如五聚体)也会诱导早期结节素的短暂表达。然而，ENOD40的持续表达需要大豆特异性的Nod信号。 The existence of two recognition events was supported by finding that expression of the early nodulin ENOD2 could not be induced by the addition of any single LCO or Nod signal. ENOD2 expression was clearly induced only when a mixture of LCO was added. One member of this mixture could be a simple, chitin oligomer, if the other member was a soybean-specific Nod signal.

目前，真正的Nod信号受体还没有被确定。Etzler等人(1999)报道了从豆科植物Dolichos biflorus的根中分离出的一种独特的凝集素(DB46)。这种凝集素被发现与来自各种根瘤菌的Nod信号结合。Etzler et al.(1999)证明凝集素具有atp酶活性(即apyrase活性)，在加入Nod信号后，atp酶活性显著提高。因此，这种凝集素被称为凝集素-核苷酸磷酸水解酶(LNP)。用荧光抗体标记法在根毛表面发现了双花草LNP(即DB46)。直接抗LNP阻断结瘤。最近，我们通过证明在其他豆科植物中存在D. biflorus apyrase (LNP)的同源物[例如大豆中的GS50、GS52 (Day et al. 2000)和M. truncatula中的Mtapyl-5 (Cohn et al. 2001)]扩展了这些研究。结果表明，大豆中的GS52和截叶菌的Mtapyl和Mtapy4是根瘤菌接种后3h内诱导的早期结节素。此外，抗GS52抗体阻断了大豆结节的形成。 M. truncatula mutants defective in very early nodulation events also were defective in Mtapyl and Mtapy4 expression. Therefore, legume apyrases must be considered as candidates for a Nod signal receptor. The Cohn et al. (2001) and Day et al. (2000) studies showed the benefit of analyzing multiple legumes. Isolation of both the soybean and M. truncatula apyrases allowed the identification of a region of microsynteny between the two genomes containing a cluster of apyrase genes.

几丁质寡聚物是由几丁质酶从真菌细胞壁生成的，在许多单子叶和一些双子叶中可以诱导防御反应或相关的细胞反应。我们之前关于Nod信号作用特异性的研究(Cohn et al. 1997)表明，一种甲壳素结合蛋白可能参与了Nod信号识别(即通过ENOD40诱导测量)。因此，Day et al.(2001)使用125i标记的APEA(氨基苯基乙胺)

将¿v -乙酰壳聚糖和iv -乙酰壳聚糖缀合物作为配体，以确定来自大豆悬浮培养细胞的微粒体膜制剂以及根制剂中的几丁质结合位点。与该位点的结合是饱和的，Kd明显约为40 nM。使用几丁质寡聚物(d.p.=2-8)的竞争实验表明，该结合位点更倾向于高分子量的寡聚物(d.p.=7-8)。使用1251标记的yv -乙酰壳聚糖酶配体进行亲和标记，在质膜上鉴定出一个85 kDa的几丁质结合蛋白。该85 kDa蛋白对各种几丁质低聚物的结合特异性与相同低聚物在大豆悬浮培养细胞中诱导氧化爆发反应和介质碱化的能力相关。用五聚体、日本芽孢杆菌Nod信号处理大豆悬液细胞也会导致中碱化。这种反应与用甲壳素五聚体或四聚体处理所表现出的反应相似。事实上，Nod信号与大豆质膜制剂的结合(通过与标记配体的竞争来测量)也显示出近似于几丁质四聚物的亲和力。从这些数据中，我们得出结论，85 kDa的几丁质结合蛋白可能参与了由真菌病原体释放的几丁质片段介导的大豆防御反应。尽管该蛋白似乎与Nod信号结合，但它的亲和力很低，可能不参与Nod信号的作用。 However, Nod signal does act as a significant elicitor of defense-related responses in soybean. Therefore, the possibility arises that Nod signal elicitation of a defense response could affect nodulation.

为了检验这种可能性，我们最近构建了表达细菌NahG蛋白的转基因莲花。这种酶催化水杨酸(SA)分解为儿茶酚。SA是已知的植物诱导防御反应的中介物。以往研究表明，转基因nahG植株不能积累SA，对病原菌的抗性降低。我们的初步数据表明，转基因L. japonicus nahG植株在根系中积累的SA显著减少，结瘤增加了约50%。这些结果与sa介导的防御机制在控制豆科植物根瘤菌感染中的作用是一致的。

继续阅读:核内再复制是杉木共生细胞分化的必要条件

这篇文章有用吗?

＋1 0