大豆uured和uuf寻找基因位点
UreD, UreF和UreG由S. pombe基因组计划(http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_pombe/)．我们利用UreD和UreF作为(i)异源探针来恢复大豆cDNA同源物，以及(ii)作为PCR引物来源来确认它们存在于S. pombe脲酶突变体的基因组DNA克隆中(由N. Honey博士慷慨提供)(Kinghorn, Fluri 1984)。我们现在正尝试用大豆同源物纠正S. pombe突变体，鉴定为ureD, ureF和ureG。
对一个eu2突变等位基因的RT/PCR分析显示其UreD或UreF ORF没有变化。如果第二个突变等位基因的序列和mRNA的定量都表明UreD和UreF蛋白在eu2/eu2中起作用，我们就必须考虑eu2编码了一个新的辅助蛋白。体外活化实验(上图)表明，Eu2与Eu3 (UreG蛋白)相互作用(Polacco et al. 1999)， Eu2 / Eu2似乎能够吸收并转运Ni (Holland, Polacco 1992)。迄今为止，在任何真核生物基因组中都没有发现UreE ORF。
对突变体AJ6的RT/PCR分析(暂定为新位点Eu5)显示，14个具有UreD同源性的cDNA克隆中有4个缺乏15 AA区域，该区域在拟南芥中定义了一个外显子(图2)。这些来自发育中的子叶的mRNA转录本为脲酶阳性(表2)。来自野生型的10个转录本中有10个是正常的。我们现在正在检查AJ6中脲酶阴性的叶片组织转录本。
阿拉伯1
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阿拉伯番茄酱油
图2。拟南芥(阿拉伯)、番茄和大豆(大豆)UreD的前120个AA(-295个)的对齐。在14个AJ6转录本中，有4个缺失15-AA序列，根据拟南芥的剪接位点(内含子3和4之间)，表示整个外显子被切除。
图2。拟南芥(阿拉伯)、番茄和大豆(大豆)UreD的前120个AA(-295个)的对齐。在14个AJ6转录本中，有4个缺失15-AA序列，根据拟南芥的剪接位点(内含子3和4之间)，表示整个外显子被切除。
如果我们假设AJ6的UreD转录本剪接受损，那么AJ6病变的位置仍有待确定。由于正常剪接的变异序列没有显示出任何变化，因此内含子连接序列可能受损。不管选择性剪接在AJ6 UreD转录本中起什么作用，选择性剪接可能是双子代中维持UreD蛋白在低水平的一种普遍机制。在克雷伯氏菌中，这是通过一个次优核糖体结合位点和一个不寻常的起始密码子实现的(Park et al. 1994)。我们已经在番茄和拟南芥中观察到高频率的错误拼接的UreD转录本，通常导致后者的外显子IV后立即引入一个终止密码子。
总之，植物脲酶激活不同于细菌:(i)植物必须激活多个脲酶，通常产生的脲酶水平相当不同;(ii)植物脲酶具有富含his的n -延伸，像细菌HypB，不像迄今为止所有的细菌脲酶;(iii)植物似乎没有镍结合UreE。(iv)植物有不同的UreD剪接方式，可能将其维持在低水平;(v)植物可能有另一种辅助蛋白Eu2。
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