方法揭示的遗传多样性colonyforming prymnesiophytes棕囊藻属南极洲但是此属P globosa和P pouchetiipreliminary结果

施特菲·Gaebler琳达•保罗·k·海斯•k Medlin

收到:2005年10月12日/接受:2006年3月17日/网上公布:2007年4月12日©Springer科学+商业媒体帐面价值2007

文摘以前的工作对棕囊藻属使用但是此属核糖体DNA的遗传多样性和内部转录间隔区(ITS)序列分析表明有大量的国际米兰,intraspe-cific属内的变异。首先尝试跟踪菌株在南极海域的生物地理学史是基于比较的序列。获得更深的见解的人口结构和开花动态microalga需要量化的种群内遗传多样性从不同位置(即p .南极洲。,每个三个主要环流在南极大陆水域)和计算它们之间的基因流动。这里我们描述方法来量化遗传多样性和我们的初步结果p .南极相比其他两个殖民物种:p . globosa和p . pouchetii。遗传多样性的研究,两个指纹识别技术。首先,放大片段长度多态性(妊娠)建立了一个

阿尔弗雷德韦格纳极地和海洋研究所Handelshafen 12,

德国不来梅港27570电子邮件:(电子邮件保护)

布里斯托尔大学生物科学学院的林地,BS8 1 ug,英国布里斯托尔

预审工具来评估之前克隆克隆多样性和选择不同的生理调查。其次,建立了功能强大的微卫星标记更准确地评估人口结构和生物地理学。结果表明妊娠模式分离株之间的差异p南极洲从不同的区域,并且可以获得各种各样的微卫星主题三个棕囊藻属的物种。但是此属

关键词妊娠••微卫星标志

棕囊藻属南极洲•p•p . globosa•p . pouchetii但是此属

介绍

属棕囊藻属竖立,但是此属Lagerheim(1893/1896),以适应殖民海藻四孢藻属pouchetii Pou-chet Hariot描述的(1892)。新物种,Phaeo-cystis pouchetii,可以找到北极水域。不久两个殖民物种描述:p . globosa由Scherffel(1899、1900)从温带水域和p .南极卡斯滕(1905)从南极。Kornmann(1955)怀疑,这些物种分离和集中了所有殖民物种到一个分类单元棕囊藻属pouchetii但是此属。尽管生理研究(鲍曼和杨克1986;Jahnke和鲍曼1986,1987;杨克1989),证实这些类群的分离,用了一个分子研究(Medlin et al . 1994年)结束争论的有效性三个殖民地的物种。从那时起进一步使用其他基因位点的分子研究证实这些类群的分离(兰格et al . 2002年)和其他物种也被包括在属(Zin-gone et al . 1999年)。

棕囊藻属,但是此属生态学与生物地球化学发挥重要作用,因为它是全球分布,形成巨大的花朵。其花朵可以解决大量二氧化碳并产生大量dimethylsulfoniopropio-nate (DMSP),即生物气候上重要的前体大气微量气体甲基(DMS)(史密斯et al . 1991;Stefels 1997;Arrigo 1999;真实性和斯1996)。p .南极洲是广泛分布在南大洋中最丰富的初级生产者,因而有机质垂直通量的主要因素。众所周知从生理研究许多phy-toplankton物种株高的差异对于每一个特征研究(木材和Leatham 1992)。因此,遗传多样性的研究和基因流在棕囊藻属菌株但是此属南极既及时和必要的。追求这我们选择两种技术来评估之间的遗传多样性和

棕囊藻属spp。但是此属的一种技术,扩增片段长度多态性,(妊娠)提供了一种快速意味着屏幕的整个基因组多态基因位点预审工具选择最不同的克隆生理调查,而微卫星位点的分析提供了一个更严格的人口遗传统计方法可以应用于评估种群的遗传多样性和它们之间的基因流动。这两种技术将被应用到三种殖民物种,但是这里我们报告初步数据为p .南极建立这些技术。

扩增片段长度多态性

妊娠技术由Vos et al。(1995)被用来描述约翰et al。(2004)。提取的基因组DNA 48棕囊藻属菌株但是此属以前在早期研究(Medlin et al . 1994;兰格et al . 2002年)在晚上消化37°C和两个限制性内切酶(EcoRI MseI,新英格兰生物学实验室,法兰克福。主,德国)。这种酶组合由一个罕见(EcoRI, six-base-pair识别序列)和频繁(MseI, four-base-pair识别序列)刀。之后消化、特定站点适配器被结扎的结束限制片段(见图1)。

图1原理图显示妊娠碎片穆勒(2005)的建设

图1原理图显示妊娠碎片穆勒(2005)的建设

放大的一个子集DNA限制性片段,1到6可以添加额外的核苷酸引物的3 '端适配器的补充和限制酶位点序列(Vos et al . 1995年)。有两个额外的聚合酶链反应(PCR)的步骤,预选式和选择性扩增,只有特定子集的片段是放大,所以由此产生的PCR产品的数量提供足够的分辨率之间的压力。太多的片段使分析困难,而太少不提供足够的分辨率。一套引物和一个选择性核苷酸引物prese-lective放大和不同数量的选择性核苷酸引物的选择性扩增比较(表1)。能够可视化放大产品的底漆是荧光标记的第二放大(EcoRI * 6 fam + NNN,应用生物系统公司,德国)。第二次放大后,样本使用毛细管电泳测序仪(ABI 3100的棱镜,应用生物系统公司,德国)。这部分妊娠优化,10选择性扩增的引物组测试使用只有四个48个不同的p .南极隔离(表3)。在图2 8的这些引物集比较孤立p .南极A1-3因为两人没有产品。所有四个隔离测试发现少选择性核苷酸用于第二步放大提供了更好的分辨率。引物组毫秒+ CT / EcoRI +在似乎是最好的选择,因为它不仅给大片段模式的分辨率从0到500个基点(碱基对),但也更有效的片段(图2)。

表1选择性核苷酸(SN)用于选择性放大。X =这些引物集已经被使用

底漆MseI + SN

C CC CT

AC X

AG) X

在X

亚美大陆煤层气有限公司X X X

ATG X X X

片段模式的棕囊藻属隔离比较但是此属引物组(图3)和引物组MseI + CT / EcoRI + AA(图4)。分离株之间的差异和相似之处很容易注意到的乐队共享之间的隔离。差异基因指纹可能会从他们biogeographi-cal距离和所谓的基因流在南极海域。比较无花果。3和4乐队的所有隔离模式是不同的。这些差异与底漆更清楚地显示设置MseI + CT / EcoRI +(图3)。从p .南极洲分离获得的片段模式引物组,一个距离矩阵(片段的存在/没有)是手动计算扩增片段的100个基点和500个基点之间只说明这四个菌株之间的相似性和差异。片段长度从100个基点,至500基点任意选择的,因为这个尺寸范围似乎现在的长度可能是最容易得分。/没有41乐队面前得分之间的长度。峰值高度低于200荧光单位(参见无花果。2、3和4)被忽略了:片段长度< 100 bp显然没有得到解决。最大的吝啬分析妊娠数据集(图5:PAUP斯沃福德,2002)表明,p .南极洲的遗传多样性南极地区是高度可变的。南极绕极流的隔离p .南极洲SK22 (ACC)(图6)被定义为外围集团基于内部转录间隔区(ITS)序列数据(兰格et al . 2002年)。隔离SK21(威德尔海)和D5 (兹湾)似乎更密切相关的相互比A1-3(兹湾),根据其分支长度判断,包含更多独特的片段长度。之前的散度A1-3(兹湾)的散度SK21(威德尔海)和D5(兹湾)的分析也恢复兰格et al . (2002)。下一步是增加的分辨率放大模式和优化引物组棕囊藻属菌株但是此属。再现性妊娠的技术必须评估通过执行复制DNA反应使用多个隔离从相同的应变;然而我们与我们的有限应变分析,相同的树拓扑中恢复过来

图2妊娠electropher-ograms(从50 - 350个碱基对决议)的八个不同的引物组p .南极A1-3(兹湾,图6)

图2妊娠electropher-ograms(从50 - 350个碱基对决议)的八个不同的引物组p .南极A1-3(兹湾,图6)

分析更多的菌株(兰格et al . 2002年)。

微卫星标记

总DNA分离出p globosa (CCMP1528), p . pouchetii (SK 34)和p .南极洲

(SK 23)(表2)使用修改后的hexadecylt-rimethylammonium溴铵(CTAB)提取协议(Doyle和柯南道尔1990;兰格1997)。核DNA被超速离心法纯化通过溴化铯chloride-ethidium密度梯度(兰格1997)。这是用于创建丰富微卫星DNA库

图3妊娠重复(决议从0 - 500个碱基对)的底漆毫秒在南极洲的p + CT / EcoRI +隔离(表2)

三个克隆形成的物种。这些库建设的协议修改略的埃文斯和海耶斯(2004),这是基于爱德华兹et al。(1996)。两个生物素化的微卫星寡核苷酸Bio-GA和Bio-GT(热电子GmbH,德国)被固定在磁珠(Dynabeads, Dynal生物技术Invitro-gen,德国)。这些寡核苷酸是用来绑定和捕获CT和CA主题限制,寡核苷酸片段适配器的结扎。第二轮浓缩是通过重新夺回postamplification Dynabead产品和重复所有协议(埃文斯和后续步骤

海斯2004年)。浓缩PCR片段克隆到威尼斯平底渔船向量(PCR®2.1威尼斯平底渔船,英杰公司,德国)和质粒DNA分离大肠杆菌使用mini-preparation-scale向导™Minipreps DNA净化系统(美国赛瓦,海德堡,德国)。合成Miniprep DNA被EtOH和resuspended H2O为70%。克隆片段直接测序使用BigDye®终结者v3.1循环测序工具包(应用生物系统公司、德国)和向量组引物:M13 HedgeF-5”-GTTTTCCCA GTCACGACGTTG 3 ';M13 HedgeR-5”tga GCGGATAACAATTTCACACAG 3 '(操纵子、德国)。

图4妊娠重复(决议从0 - 500个碱基对)的底漆MseI + CTEcoRI + AA的p .南极隔离(表2)

十八个克隆片段克隆片段从南极p和17 p . globosa和p . pouchetii测序。其中,14个克隆片段p .南极和九个克隆片段p . globosa和p . pouchetii包含重复序列。初步结果表明微卫星的高可变性图案(表3)。至少50进一步克隆将从每个物种测序允许额外的微卫星重复和他们的侧翼序列的特征。在fl底漆对退火安庆的微卫星序列

重复将与程序设计引物3.0 (http://www.frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3 / primer3_www.cgi)。微卫星的主题表3所示,只有简单的重复将进一步追究:复杂嵌套的图案太难以分析。

这些初步结果表明,棕囊藻属遗传多样性,但是此属这种多样性可以量化和解释的基础上,使用妊娠和女士微卫星,我们将能够计算p基因南极绕流南极洲。

表2藻类物种用来测试最佳引物组和创建microsatellite-enriched库

菌株	文化的数字,	地理

继续阅读:棕囊藻属的状态但是此属的生命周期在生态知识和既定的角色

这篇文章有用吗?

0 0