大规模生产

昆虫病原线虫大规模生产的两种不同技术是(i)体内，和(ii)体外。昆虫病原线虫的产量取决于所应用的面积以及所使用的线虫种类的类型。如果是小块地用于研究目的，体内生产技术是合适的，否则用于野外则采用体外生产方法。

13.3.5.1体内生产

白色诱捕法(White 1927)是昆虫致病性线虫最常用的诱捕方法之一。昆虫病原线虫接种在有滤纸衬里的培养皿上。2-5天后，将受感染的昆虫转移到白色陷阱中。白色陷阱包括一个倒置的手表玻璃，放置在一个培养皿上，在培养皿上放置适当大小的Whatman纸，并用消毒蒸馏水浸湿。手表玻璃表面和周围也要保持足够的蒸馏水。当感染的幼鱼从尸体中出来时，它们会迁移到周围的水中并被困住。从白色陷阱中收获线虫，并在烧杯中收集。线虫的集中可以通过

图13.1昆虫病原线虫Steinernema masoodi在Galleria mellonella幼虫体内繁殖(转载自Ali et al. 2005b)

重力沉降(Dutky et al. 1964)和/或真空过滤(Lindergen et al. 1993)。在体内产生的昆虫病原线虫具有高毒力和传染性。大蜡蛾的最后一个幼虫G. mellonella通常用于昆虫病原线虫的体内生产，因为这种昆虫高度敏感，容易获得，产量高(图13.1)(Woodring和Kaya 1988年)。

其他鳞翅目和鞘翅目也被用于线虫的体内生产(Shapiro-Ilan和Gaugler 2002)。线虫的产量取决于寄主的大小。一般来说，线虫的产量与寄主昆虫的大小成正比(Blinova和Ivanova 1987;Flanders et al. 1996)，然而，每毫克昆虫的产量(宿主物种内)和对感染的易感性与宿主的大小或年龄成反比(Dutky et al. 1964;Shapiro-Ilan et al. 1999)。体内技术的主要缺点是生产成本偏高，因为需要同时培养寄主昆虫和昆虫病原线虫两种不同的生物。但这种限制并没有限制生产技术作为家庭手工业来维持自身(Gaugler et al. 2000;Gaugler和Han 2002)。昆虫病原线虫的体内生产可能继续作为利基市场或劳动力成本较低的国家的小型企业。雷竞技手机版app在受感染的宿主尸体上生产和应用昆虫病原线虫也是鼓励该技术的另一种选择(Shapiro-Ilan et al. 2001,2003)。

13.3.5.2体外培养

床上用品(1984)开发了一种技术，利用多孔聚氨酯泡沫基材上的鸡、鸭或火鸡的排泄物介质，可以经济地生产大量具有传染性的幼崽。这种方法中使用的饲养容器是一个玻璃烧瓶或高压灭菌的塑料袋，用水族馆泵充气，每克培养基中接种约2000只感染幼鱼。这种方法可用于平均每袋500毫升容量的烧瓶(100克培养基)产生10亿只感染幼崽。目前，一些公司，如Andermatt(瑞士)、Bionema(瑞典)、Oviplant(波兰)和Biologic(美国)正在使用这种线虫生产技术(Ehlers和Shapiro-Ilan 2005)。这项技术包括以下步骤。

饲养瓶/袋的准备

小块泡沫用鸡肉、鸭子或火鸡内脏匀浆浸渍，按重量按12.5份中份到一份泡沫的比例浸渍。将此泡沫匀浆混合物装入容量为500毫升的宽口Erlenmeyer烧瓶中至250-300毫升(约100克)。擦拭烧瓶口，用棉花堵塞，用奶酪细布包裹，在121℃下高压灭菌20分钟。

细菌接种

适当的异enorhabdus或Photorhabdus细菌细胞无菌转移到5毫升的试管营养肉汤中，并在搅拌器上保持一夜。通过倾倒一个培养管的内容物，将含有高压灭菌材料的烧瓶接种细菌培养物。将烧瓶摇匀，在25°C下储存2-3天，以允许细菌繁殖。

用线虫接种

每个定植有细菌的烧瓶，在5毫升消毒蒸馏水中接种表面灭菌的500- 1000个适当种类的感染幼菌，并在25°C下培养。接种后的烧瓶不宜剧烈摇晃，以使线虫更好地取食和繁殖。

收获

线虫可以在大约15天内从烧瓶中收获。取一个20目的筛子，在上面堆上5厘米深的泡沫片。然后将筛子放在平底锅中，放在水龙头附近，调节好水位，使泡沫片浸入水中。静置2小时。在此期间，有感染的幼虫会迁移到水中。这些线虫可以沉淀和冲洗，以去除颗粒物质和不活跃或死亡的幼虫。这样得到的感染幼体应用专门的蒸馏水冲洗几次，使悬浮液清晰。各种其他合成培养基已用于昆虫病原线虫的大规模培养(表13.3)。

表13.3昆虫病原线虫的推荐培养基

合成培养基	线虫种类	潜伏期	温度	线虫收获	参考
牛肉提取物，蛋白胨，玉米粉，水	Steinernema	-	-	-	李(1984)
在海绵	feltiae
狗粮琼脂培养基	美国feltiae	-	-	10-Vg介质	Hara et al. (1981)
肾脏匀浆/脂肪	feltiae S. bibionis S. glaseri Heterorhabditis bacteriophors . heliothidis	2 - 3周	25°C	2.9x10773 flasks 8x10711 flasks 3.6x10710 flasks 3.2 x10715烧瓶	床上用品(1981)
3%大豆蛋白胨+ 3%酵母提取物+ 10%	美国glaseri	-	-	lOVweek 93天	Tarakanov (1980)
鸡胚提取液
营养肉汤酵母提取物植物油。	h . heliothidis	4周	25°C	107250毫升烧瓶	Wouts (1981)
面粉涂在海绵上
麦麸+色拉油	美国feltiae	3周	25°C	107克中	安(1987)
麦麸	美国feltiae	3周	25°C	107克中	安(1987)

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