冻土菌株
已知不同系统群的细菌具有不同的内在特征抗生素耐药性；此外，它们可能对几种抗菌药物具有交叉耐药[Piddock, 2006]。细菌也可能通过水平转移其他生物的特定基因而获得耐药性[Davies, 1994;Tenover, 2006]。为了研究我们收集的耐多药冻土细菌的抗生素耐药机制，我们确定了耐药基因的定位及其与不同移动元件(质粒和转座子)的可能联系。
我们首先分析了耐药决定因子是否具有质粒定位。事实上，研究表明，大多数永久冻土抗生素耐药菌株含有不同大小的质粒(数据未显示)。为了分析耐药基因的质粒定位，选择具有较大质粒的耐药菌株(见图2)。质粒DNA采用碱性裂解法提取，在三硼酸盐缓冲液中用0.7 % (wt/vol)琼脂糖凝胶电泳分析，然后用溴化锑染色并在紫外光下显示[Sambrook et al.， 1989]。通过与参考质粒R388 (34 kb) [Datta & Hedges, 1972]和RP4 (60 kb) [Jacob & Grinter,1975]进行比较，评估质粒的分子大小。
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- 图2。从永久冻土中分离出的细菌菌株的质粒。水平琼脂糖凝胶电泳(50V 18h): 1=Tik1, 2=R388, 3=ED6-1, 4=RP4, 5= mr29 - 12,6 = ed94 - 71,7 = ed23 - 26,8 = ed23 - 35,9 =ED45-25
为了进行详细的研究，我们选择了5株假单胞菌、3株不动杆菌和1株嗜冷杆菌，每株都含有单个大质粒(约25-55 kb)(见图2)。在实验室受体菌株的偶联和转化实验中确定了耐药基因与R质粒的关联。对于不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)和Psychrobacter，不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)菌株BD413rif作为受体;对于假单胞菌，使用荧光假单胞菌P22-1-2(表3)。需要注意的是，荧光假单胞菌对四种不同抗生素(Cb、Cm、Sp、Tp)均耐药。因此，通过偶联实验在假单胞菌菌株中相应的耐药决定因子与质粒的关联不能得到确切的评估。
我们确定在四个菌株中，只有汞抗性转移到合适的受体;其中三个，汞和链霉素耐药决定因素均被转移，另外两个质粒定位分别显示了链霉素和四环素耐药，以及链霉素和磺胺噻唑耐药(表3)。
电阻 |
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冻土菌株 |
耐药模式 |
与R质粒相关的决定因子 |
不动杆菌sp. ED23-35 |
Hg, Sm, Sp |
Hg, Sm |
不动杆菌sp. ED45-25 |
Hg, Sm |
Hg, Sm |
jonsonii不动杆菌M2-7 |
Ap Hg Tp |
Hg |
嗜冷杆菌MR29-12 |
Sm Tc Tp |
Sm, Tc |
荧光假单胞菌ED23-26 |
Hg Km Cb Cm Sp Tp |
Hg |
假单胞菌ED94-71 |
Hg Km Cb Cm Sp Tp |
Hg |
假单胞菌(荧光)edm1 -1 |
Hg、Cb、Tp |
Hg |
恶臭假单胞菌Tik1 |
Hg Km Cb Cm Sp Tp |
Hg, Sm |
假单胞菌Tik3 |
Sm Su Cm Sp Tp |
Sm,苏 |
收件人的特性: |
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钙化不动杆菌BD413rif |
(rif-r) |
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荧光假单胞菌P22-1-22 |
Cb, Cm, Sp, Tp [str-r, rif-r] |
|
耐药决定因素在假单胞菌受体菌株中也存在，因此不能通过质粒转移进行分析，在与不动杆菌和嗜冷杆菌菌株交配时以粗体显示;用于与假单胞菌菌株的配合;str-r - 30s -核糖体抗性;rna聚合酶基因rpoB的突变
耐药决定因素在假单胞菌受体菌株中也存在，因此不能通过质粒转移进行分析，在与不动杆菌和嗜冷杆菌菌株交配时以粗体显示;用于与假单胞菌菌株的配合;str-r - 30s -核糖体抗性;rna聚合酶基因rpoB的突变
为了研究r质粒在不同细菌间抗性传递中的可能作用，我们确定了揭示的冻土质粒的寄主范围。在偶联实验中，使用实验室菌株P. fluorescens P22-1-2、A. calcoaceticus BD413rif和E. coli K-12 C600rif作为受体。结果表明，这些质粒均不具有在不相关细菌之间传播耐药标记的广域宿主质粒的特性(表4)。同时，一些假单胞菌的质粒转移到其他假单胞菌种的菌株中。例如，恶臭假单胞菌Tik1和P. sp. ED94-71(非荧光)的质粒可以在恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌的不同实验室菌株之间转移(未显示)。
有趣的是，在假单胞菌和不动杆菌的研究质粒中，我们发现了几个只含有汞抗性基因的质粒。同时，我们成功地检测到R质粒同时具有耐汞和耐抗生素的决定因素。在这方面，应该注意的是，在临床假单胞菌质粒的历史上，对HgCl2的耐药性是1969年之前发现的第一个标记。随后研究的假单胞菌耐药质粒除了对汞的耐药外，还对不同家族的抗生素具有耐药性[Kontomichalou, Papachristou & Angelatou, 1976]。因此，我们的结果支持先前的结论[Hughes & Datta, 1983;
Davies, 1994)，抗生素耐药性决定因素可能被细菌质粒“拾起”，这是在医学和兽医实践中引入抗生素的结果。同样的现象也可能发生在环境中，但比例要低得多。
携带r质粒的供体菌株 |
r质粒与受体株杂交的传递能力 |
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不动杆菌BD413rif |
假单胞菌P22-1-2 |
大肠杆菌C600rif |
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不动杆菌sp.ED23-35 |
+ |
- |
- |
不动杆菌sp.ED45-25 |
+ |
- |
- |
P. psychrophilus MR29-12 |
+ |
- |
- |
P. fluorescens ED23-26 |
- |
+ |
- |
P. sp.(非荧光)ED94-71 |
- |
+ |
- |
P. putida Tik1 |
- |
+ |
- |
观察到r质粒+转移;-传输不存在
观察到r质粒+转移;-传输不存在
我们进一步分析了具有质粒定位的抗生素耐药决定因素是否与转座子相关。我们分别从嗜冷嗜冷杆菌MR29-12和假单胞菌Tik3中成功分离出两个含有抗生素耐药基因的转座子(见表2和表3)。第一个转座子携带具有链霉素和四环素耐药的决定因子;其次是链霉素和磺胺噻唑。[Petrova et al.， 2008]。我们进一步证明，这两种转座子都可以转移到具有广谱宿主谱的质粒上，并可以转移到不同系统类群的细菌中，包括大肠杆菌和假单胞菌(数据未显示)。进一步鉴定冻土细菌菌株中的r质粒和抗生素耐药性转座子将是未来研究的重要目标。
对于我们收集的大量耐药菌株(特别是各种假单胞菌和不动杆菌菌株)，抗生素耐药决定因子既不能通过质粒DNA偶联转移也不能通过质粒DNA转化转移。有人认为，在这种情况下，抗性表型可能源于染色体编码的内在抗性[Gomez & Neyfakh, 2006]。为了验证这一假设，我们分析了与质粒无关的抗性决定因素是否可以通过基因组DNA转化在物种之间转移。
以不含质粒的耐多药不动杆菌菌株MR5-11和VS15为供体菌株，以转化能力强的实验室模式不动杆菌菌株calcoaceticus BD413ivl (Ivl-10)为受体菌株[Juni, 1972]。对于基因组DNA的转化，使用了针对不动杆菌(Acinetobacter spp)描述的一种简单的转化试验程序[Juni, 1972]。如[Sambrook等人，1989]所述，从供体菌株制备粗转化DNA。我们使用氯霉素耐药(CmR)作为跟踪抗生素耐药性转化的标记表型。为了评估转化的效率，我们比较了氯霉素抗性转化的频率(CmS^CmR)与从增殖型向原生型转化的频率(Ivl-^ Ivl+)。
实验结果(表5)显示，BD413ivl与原营养BD413株分离DNA的同源转化频率(2.3 x 10-5)超过了与冻土不动杆菌株分离DNA的异源转化频率(1.6x10-6和7 × 10-6，表5)，这与已发表的不动杆菌种同源和异源转化效率的数据一致[Juni, 1972]。我们还观察到耐氯霉素的冻土区菌株向敏感菌株BD413 ivl的氯霉素抗性(Cm-r)转变。Cm-r变换的频率(2.8-9.0 0x10-7)与Ivl-^ Ivl+变换的频率相当。值得注意的是，以对照氯霉素敏感株为DNA源时，未观察到氯霉素抗性的转化(表5)。
DNA来源 |
转换频率(每1p。L“DNA) |
|
Ivl + |
Cm-r |
|
VS15 (Ivl + Cm-r) |
1.6 x 1 q 6 |
9.Q x 1Q-7 |
MR5-11 (Ivl + Cm-r) |
7.Qx 1 q 6 |
2.8 x1Q-7 |
BD413 (Ivl + Cm-s) |
2.3 * 1Q-5 |
< 2。问x1Q-8 |
转换的频率被确定为一个比率的数目转化株与受体菌落总数的比值
转化频率以转化子数量与受体菌落总数的比值来确定
考虑到单个染色体基因可以对不同抗生素产生内在抗性[Poole, 2005;Piddock, 2006]，我们比较了BD413 Cm-r转化子的耐药模式与原始耐药不动杆菌菌株的耐药模式。我们特别分析了转化子对链霉素、大霉素、甲氧苄氨嘧啶和非特异性DNA插层剂溴化乙啶的耐药性。为了评估抗生素耐药性水平，我们使用了双重连续稀释技术[Hirai等人，1986年]。耐药性的获得定义为最小抑制浓度(MIC)至少增加四倍。对抗生素敏感性模式的分析表明，Cm-r转化子对链霉素、大霉素和甲氧苄氨嘧啶也显示出更高水平的耐药性。此外，它们对溴化乙锭的耐药性增强(表6)。因此，野生型不动杆菌VS15和MR5-8的耐药模式可以通过染色体DNA转化转移到同一属的实验室菌株上，这表明多药耐药表型可以用染色体编码的内在耐药来解释。事实上，这种内在的耐药性在某些不动杆菌中已经被描述过[Magnet et al.， 2001;Gomez & Neyfakh, 2006]。
表6所示。冻土不动杆菌和实验室菌株之间抗生素耐药性模式的转移
表6所示。冻土不动杆菌和实验室菌株之间抗生素耐药性模式的转移
应变 |
麦克风(| g / ml) |
||||
厘米 |
Sm |
Sp |
Tp |
EthBr |
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多年冻土抗性菌株 |
|||||
MR5-11 |
64 - 128 |
> 256 |
256 |
32 |
128 |
VS15 |
> 32 |
> 256 |
> 256 |
32 |
64 |
实验室敏感菌株 |
|||||
BD413ivl |
8 |
4 - 8 |
8-16 |
8 |
至少需要补充16至32 |
转化株 |
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BD413ivl / VS15 |
64 |
> 128 |
128 |
32 |
128 |
BD413ivl / MR5-11 |
64 |
> 128 |
128 |
32 |
128 |
mic是在三个独立的实验中使用Mueller-Hinton培养基进行琼脂稀释法测定的;Cm-chloramphenicol;Sm-streptomycin;Sp-spectinomycin;Tp-trimethoprim;EthBr -溴化乙锭。
mic是在三个独立的实验中使用Mueller-Hinton培养基进行琼脂稀释法测定的;Cm-chloramphenicol;Sm-streptomycin;Sp-spectinomycin;Tp-trimethoprim;EthBr -溴化乙锭。
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